Fazendo sequenciamento de DNA em casa
(bradleywoolf.com)- Para quem quer tentar fazer sequenciamento genômico com equipamento próprio, o procedimento real de home lab e os equipamentos necessários são organizados em um fluxo contínuo, da coleta de células da bochecha à análise de VCF
- As células da parte interna da bochecha usadas como amostra experimental são fáceis de obter, mas não servem para perguntas que exigem contexto tecidual, como diagnóstico de câncer ou análise de inflamação e expressão gênica em tecidos específicos
- O valor dos dados genômicos não está tanto em obter um diagnóstico imediato, mas em transformar o VCF em uma camada de referência consultável para explorar variantes com VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude etc.
- A preparação levou cerca de dois meses, e só o MinION custa cerca de US$ 7.500; considerando equipamentos, reagentes, consumíveis e ambiente de análise, ainda há uma grande barreira de custo para a pessoa média
- Execuções de baixo input e baixa cobertura devem ser vistas como validação técnica, não como interpretação de grau médico, e é importante não superinterpretar variantes com baixa cobertura
Escopo e limites do sequenciamento de DNA em casa
- Baseia-se na experiência de sequenciar o próprio genoma 5 vezes com o Oxford Nanopore Technologies MinION
- Coletar células da parte interna da bochecha com um swab
- Preparar a amostra para sequenciamento
- Carregar no sequenciador
- Analisar os dados resultantes
- Células da bochecha são fáceis de obter e se renovam rapidamente, mas não são adequadas para todas as perguntas biológicas
- Não são usadas para diagnóstico de câncer
- Não servem para diagnosticar inflamação ou identificar genes ativados em outras partes do corpo
- Para ver genes expressos em células inflamatórias de uma área de urticária no peito, seria necessário comparar as células problemáticas com células normais
- A preparação completa levou cerca de dois meses, e o custo ainda está em um nível difícil de acessar para a pessoa média
- Os custos estão caindo
- No longo prazo, considera-se possível uma tecnologia que informe a expressão de DNA e RNA em tempo real, como celulares ou IA
O que dá para fazer com dados genômicos
- O genoma não é “mágica”, mas uma camada de referência; com um VCF, ele pode ser consultado por várias ferramentas
- As ferramentas utilizáveis incluem VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude etc.
- Com base no VCF, é possível explorar perguntas como:
- Quais variantes você tem
- Quais genes e vias são afetados
- Quais medicamentos você pode metabolizar de maneira diferente
- Quais variantes raras devem ser analisadas com seriedade
- Quais áreas o modelo ainda não conhece
- As informações geradas ainda não são de nível diagnóstico
- Também não levam a conclusões do tipo “como a IA disse, edite a si mesmo com CRISPR”
- O valor mais imediato está em transformar um genoma estático em uma forma consultável
- O DNA é uma referência estável, enquanto o RNA é mais próximo do estado atual; no longo prazo, considera-se possível integrar dados de biossensores em um único modelo pessoal
Equipamentos e consumíveis necessários
- O hardware central é o Oxford Nanopore Technologies MinION, que custa US$ 7.500
- Notebook ou workstation para executar o MinKNOW
- Armazenamento de 100 GB ou mais para a saída
- GPU para basecalling com Dorado
- Vortex, heat block, centrífuga
- Os principais consumíveis incluem kit de sequenciamento da ONT, kit de lavagem de flow cell, materiais de controle, PBS e swabs para células da bochecha
- Os reagentes se dividem em extração de DNA, preparo de biblioteca, priming da flow cell e quantificação
- NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit for Cells & Blood: US$ 87 para 5 execuções
- NEBNext Companion Module v2: US$ 760 para 24 reações
- Oxford Nanopore SQK-LSK114: US$ 720 para 6 reações
- nuclease-free water, fluorômetro Qubit, Qubit dsDNA BR ou HS Assay Kit
- Equipamentos de bancada e consumíveis plásticos também são necessários separadamente
- microcentrifuge, magnetic rack, tube racks, ice bucket, -20°C freezer, 4°C fridge, pipettes
- sterile cheek swabs, LoBind tubes, PCR tubes, Qubit assay tubes, filtered tips, wide-bore P200 tips, gloves
Fluxo do experimento: da coleta à biblioteca final
- O objetivo geral é transformar 2 amostras de swab da bochecha em uma biblioteca que possa ser sequenciada no MinION
- A etapa de preparação inclui colocar luvas, limpar a bancada, rotular tubos, equilibrar AMPure XP beads à temperatura ambiente, manter enzimas refrigeradas, ajustar o heat block para 56°C e conferir os reagentes da ONT
- A coleta e concentração de células seguem o fluxo de raspar a parte interna da bochecha por 60 segundos, colocar em PBS e obter um pequeno pellet branco ou acinzentado por centrifugação
- O PBS pode ficar um pouco turvo
- É importante não aspirar o pellet
- Com o kit Monarch, as células são lisadas e o DNA é ligado às capture beads
- Após a lise, a prioridade é preservar DNA de alto peso molecular, portanto não se usa vortex
- As beads com DNA ligado não devem ser perdidas
- O gDNA Wash Buffer já deve ter ethanol adicionado
- O DNA genômico purificado é quantificado com Qubit
- Usa-se 1x dsDNA High Sensitivity
- Se a concentração da amostra for baixa demais, mede-se novamente com mais DNA em um novo tubo Qubit
- Se apenas DNA for adicionado ao tubo existente, o cálculo do assay é invalidado
- A melhor pausa é logo após a extração de DNA
- Rotular claramente um tubo DNA LoBind
- Fazer quick spin e armazenar refrigerado a 4°C, sem vortex
Preparo da biblioteca e carregamento da flow cell
- O input ideal para repair/end-prep é 1.000 ng de DNA em 47 µL
- Se o DNA estiver diluído demais para chegar a 1.000 ng em 47 µL, usa-se o maior volume possível
- Um exemplo de primeira execução de baixo input foi 0,296 ng/µL × 47 µL, cerca de 13,9 ng; estava muito abaixo do input recomendado, mas foi útil para praticar o fluxo de ponta a ponta
- No repair/end-prep são usados FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix e N-Prep Enzyme Mix
- Salt-T4 DNA Ligase não é usado nessa etapa, mas depois
- Se DCS não for usado, o 1 µL opcional de DCS é substituído por nuclease-free water
- Após o AMPure cleanup, adaptadores ONT são adicionados por adapter ligation
- A reação inclui repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase e LA
- Sem LA, não se forma uma biblioteca sequenciável
- Sem Salt-T4 DNA Ligase, a ligation dos adaptadores falha
- Se LNB não for bem misturado, a chemistry de ligation fica pior
- Evita-se vortex, pois ele pode causar shearing do DNA
- O cleanup da adapter-ligated library usa LFB, não ethanol
- A regra prática é “Liquid moves. Beads stay.”
- Beads não são transferidas para a biblioteca final
- A biblioteca final também é quantificada novamente com Qubit
- Execuções de baixo input podem apresentar valores baixos ou falhar
- Em uma execução de prática, é possível seguir com o loading mix usando 12 µL de library sem consumir a biblioteca repetidamente no Qubit
Execução no MinION e processamento de dados
- No MinKNOW, verifica-se a flow cell e registra-se o número de active pores
- Mais de 1200: bom
- 800–1200: utilizável
- 500–800: limítrofe ou para prática
- Menos de 500: ruim, mas permite prática mecânica
- Menos de 200: praticamente pouco valor além de praticar o carregamento
- Na etapa final, há três tubos a serem manuseados
- Final library: DNA library após o cleanup de adaptadores
- Priming mix: para preparar a flow cell
- Loading mix: inclui final library, sequencing buffer e library beads
- A flow cell tem duas portas
- Priming port: fica sob a sliding cover e recebe o priming mix
- SpotON sample port: pequeno sample well onde o loading mix é colocado gota a gota
- A Final library não é colocada diretamente na flow cell; primeiro é adicionada ao loading mix tube
- As configurações básicas do MinKNOW são:
- Flow cell type: FLO-MIN114
- Kit: SQK-LSK114
- Basecalling: ON
- Model: High-accuracy / HAC
- Barcoding: OFF
- Alignment: OFF
- Adaptive sampling: OFF
- Raw reads / POD5: ON
- Filtering: OFF em execuções de prática de baixo input
- Em execuções de prática de baixo input, é recomendável ativar raw POD5 para permitir análise posterior, mesmo que a live output não seja boa
Pipeline de análise
- Se necessário, faça o basecalling com Dorado após a execução
dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam- Se necessário, converta para FASTQ com
samtools fastq calls.bam > reads.fastq - Para uma verificação inicial rápida, é possível usar HAC em vez de SUP
- Usa-se GRCh38 FASTA como human reference
- Crie um reference index com minimap2
- Alinhe os reads com
map-ont - Gere o BAM index e o flagstat com samtools, e verifique a coverage com mosdepth
- A chamada de variantes usa Clair3 e o modelo ONT
- A saída deve incluir um VCF
- Não superinterprete variantes de baixa coverage
- A primeira execução no MinION deve ser tratada como validação técnica, não como interpretação de grau médico
- A annotation consiste em instalar o VEP e anotar o VCF com base no GRCh38
- Adicione ClinVar, gnomAD e PharmGKB
- A tabela final inclui chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth e variant quality
Referências
- Seth Howes protocol: referência de custos e protocolo para sequenciar o genoma em casa
- Quantifying Life: apresentado como um material muito subestimado
- Integrated Drug Discovery Technologies: apresentado como livro de referência
1 comentários
Opiniões no Hacker News
Não quero fazer o sequenciamento por conta própria em casa, mas gostaria de experimentar com um serviço de terceiros que entregue todos os dados brutos
Sou um consumidor comum morando na Europa e queria recomendações de qual serviço usar. Seria uma grande vantagem se a empresa não armazenasse os dados, mas não sei se dá para exigir tanto assim
Veja o caso do vazamento da 23andMe: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
Se você pedir, eles também fazem sequenciamento de genoma completo de alta resolução. Mas demora bastante, e dizem que se reservam o direito de cancelar o pedido se você reclamar dos atrasos. Não é a opção mais barata, mas, do ponto de vista da privacidade para europeus, acho bem boa. Quanto mais importante for a privacidade, mais uma empresa um pouco “difícil de lidar” pode acabar sendo melhor
Ele disse que já tinha feito isso diretamente em vários países, mas ainda não sei se as pessoas o ajudaram por causa do cargo dele. Mesmo assim, ele parecia confiante de que, mesmo sendo apenas um engenheiro de software, seria possível encontrar alguém disposto a ajudar. Se houver um instituto de pesquisa por perto, vale tentar
O principal motivo da escolha foi que havia uma opção barata de 30 euros no momento
O motivo para precisar de leituras longas é que a informação que quero está em genes duplicados quase idênticos. Tenho arquivos FASTQ e BAM que recebi da Dante Labs, mas não consegui extrair deles a informação que queria
Não entendo que tipo de mágica é essa parte que diz: “Este documento foi feito para ser lido por IA, então copie a URL, cole no ChatGPT e receba orientação. Se você tiver óculos de AR, melhor ainda, porque a IA pode acompanhar todo o protocolo”
Dá para ler diretamente, mas o conteúdo é bem denso
Já pensei em uma empresa que retirasse raízes de canos de esgoto, identificasse de que planta são por sequenciamento se necessário, e dissesse o que precisa ser morto antes que o cano desabe
Se isso puder adiar por alguns anos uma troca de esgoto de 10 mil dólares, acho que muita gente pagaria 100 dólares
https://www.envirodna.com/
https://www.naturemetrics.com/species-detection
https://www.ednacollab.org/industry/
https://wilderlab.co/
Essas empresas se concentram em DNA ambiental. Algumas são mais voltadas a monitoramento por governos locais, enquanto outras também atendem clientes individuais
Não entendo bem por que isso seria necessário. Em que medida um método para matar uma planta específica é melhor do que um método voltado para todas as plantas que possam estar ali? Daria para combinar vários tipos de tratamento herbicida, e imagino que essa opção talvez seja mais barata que o custo desse serviço
É uma ideia realmente esperta, e, nas condições certas, eu certamente pagaria
Mas, pensando bem, será que despejar algo como um herbicida biodegradável de amplo espectro no ralo não produziria o mesmo efeito por menos dinheiro?
Fico curioso sobre como abordar a questão de fazer um número suficiente de pessoas conhecer e contratar o serviço. Isso me faz pensar em uma oportunidade mínima viável de negócio
É difícil até fazer um encanador bater à porta de casa por menos de 100 dólares. Fico na dúvida se você quis dizer 500 dólares, ou se os 100 dólares seriam só pela parte da análise de laboratório
Gostaria que houvesse uma discussão sobre os resultados. Relatos anteriores sobre este sensor e este processo tiveram avaliações bem mistas
O processo em si é legal, mas queria saber quão úteis são os resultados obtidos em um ambiente real
https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/
Para algo rápido e relativamente barato, existe uma opção de 599 dólares
Por 7.500 dólares ou mais, dá para obter privacidade garantida. Outras características podem variar, como dizem os comentários, mas pelo menos os dados não saem de casa
Quero fazer sequenciamento, mas não quero que nenhuma empresa, governo ou organização religiosa tenha acesso aos meus dados.
Quando o autor disse que “se você tiver um VCF, pode rodá-lo em ferramentas como VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector e Claude”, isso não significa que meus dados vão parar justamente nas mãos dessas entidades que quero evitar?
Já no caso do Claude, sim, você estaria entregando os dados. Mas essa etapa não é obrigatória. Ao rodar um pipeline padrão, você obtém um arquivo VCF contendo as variantes genômicas e pode anotar cada variante. Ao verificar os genes anotados, dá para avaliar se uma variante é patogênica, possivelmente patogênica, de baixa patogenicidade ou benigna
É realmente impressionante que um objeto do tamanho da palma da mão consiga fazer isso. Se surgir até um dispositivo CRISPR de tamanho parecido, aí já vai estar virando o enredo de Gattaca, então talvez seja melhor parar por aqui
Tenho experiência em extrair DNA e fazer sequenciamento em laboratório úmido, embora tenha sido há quase 20 anos, e esse trabalho é difícil e falha bastante. Especialmente sem um ambiente extremamente limpo, ele falha muito mais
Mesmo depois que os dados são gerados, é preciso se perguntar o quão precisos eles são considerando o ambiente de coleta, e também examinar erros de sequenciamento correlacionados que talvez não tenham sido considerados. Além disso, aconselhamento genético é de fato uma especialidade que as pessoas estudam. Antes de perguntar a um grande modelo de linguagem o que seus dados genéticos significam para você, é preciso ter acesso a alguém que consiga contextualizar os dados e conectá-lo a especialistas relevantes. Mesmo tendo doutorado nessa área, eu não teria confiança para interpretar meus próprios dados de forma fria e racional
Além disso, não sei por que o link para Molecular Biology of the Cell aponta para a 6ª edição, e não para a 7ª, lançada há 4 anos. Nas três primeiras edições, um dos coautores foi meu orientador no meu primeiro doutorado, e ele foi quem mostrou que a ideia de Roger Penrose de que microtúbulos eram importantes na quimiotaxia de E. coli era uma bobagem completa. Era uma pessoa brilhante. Em 2007, analisei dados da Illumina que eram comercialmente muito iniciais, e como era possível alinhá-los a um genoma de referência, conseguimos identificar certos vieses. É bem provável que a tecnologia de nanoporo tenha ainda mais vieses desse tipo, e, se você não tiver capacidade de levá-los em conta, pode se meter em uma grande enrascada
Também vejo assim, falando como alguém com mestrado em bioquímica
Em vez de usar uma empresa de genômica pessoal, outra opção é contratar uma empresa que oferece serviços terceirizados de sequenciamento para laboratórios. Concordo totalmente quanto aos riscos da interpretação
Gostei da preocupação com privacidade. Tirando o problema óbvio de “rodar no Claude”, fico curioso para saber quantas das ferramentas de análise mencionadas são totalmente open source ou ao menos permitem execução local
Teria sido bom se o texto abordasse isso
Como posso saber se o resultado que recebi é real ou se é simplesmente lixo?