- O custo do sequenciamento de DNA está caindo mais rápido do que a Lei de Moore
- Com o Oxford Nanopore MinION, é possível sequenciar DNA em casa por cerca de US$ 1.100
- No experimento real, foram feitas etapas de coleta de sangue, extração de DNA e sequenciamento com nanoporo, entre outras
- Como resultado, apenas cerca de 13% do genoma completo foi coberto e a análise foi limitada por contaminação, defeito de equipamento etc.
- Ainda assim, foi uma experiência significativa de sequenciar parte do DNA pessoal de forma econômica
Introdução
- O custo do sequenciamento de DNA está caindo rapidamente, e decifrar o genoma humano, que antes levou US$ 2,3 bilhões e 13 anos, agora pode ser feito em até 48 horas apenas com o equipamento Oxford Nanopore (cerca de US$ 1.000)
- Antes, era necessário enviar amostras para terceiros terceirizados instáveis, mas este texto descreve uma tentativa de sequenciamento sem ter um laboratório próprio
Visão geral do processo de sequenciamento de DNA
- O objetivo é obter a sequência do genoma humano (cerca de 3 bilhões de bases, feitas de A, C, G e T) a partir de 10 ml de sangue
- Resumo de todas as etapas
- Coleta de sangue
- Extração de DNA humano a partir do sangue
- Passagem do DNA extraído pelo aparelho da Oxford Nanopore por meio de um método elétrico para leitura de cada base
História rápida do sequenciamento de DNA
- Era Sanger (1960~2003): abordagem analógica, processamento manual e progresso muito lento
- Usa nucleotídeos defeituosos para interromper a replicação do DNA, separa cada fragmento por eletricidade e depois faz a leitura como em um código de barras
- O sequenciamento do genoma humano levou 13 anos e US$ 2,3 bilhões
- Era Illumina (2005~década de 2010): paralelização e automação
- Introduziu o sequenciamento baseado em síntese, melhorando drasticamente a velocidade e eficiência de processamento
- Era do sequenciamento de molécula única:
- Lê diretamente as bases de DNA por meio de nanoporos elétricos, sem necessidade de fragmentar os pedaços
- Este experimento também usou esse método
Equipamentos e custos necessários
- Kit inicial Oxford Nanopore MinION (US$ 1.000): sequenciador USB, flow cell e reagentes de preparo incluídos
- Kit de extração de DNA Zymo (amostra gratuita)
- Centrífuga de bancada pequena (Amazon, US$ 50)
- Materiais de consumo de laboratório (tubo Eppendorf, lanceta, pipeta etc., US$ 50)
- Custo total de cerca de US$ 1.100
Detalhes das etapas do experimento
Etapa 1: Coleta de sangue
- É necessário cerca de 200 µL (0,2 mL) de sangue; como a lanceta pequena não fornece volume suficiente, a coleta foi feita fazendo várias punções no dedo
Etapa 2: Extração de DNA
- O sangue contém muitos contaminantes como glóbulos vermelhos, que em grande parte não possuem DNA
- É preciso isolar apenas o DNA dos glóbulos brancos, e isso foi feito usando enzimas do kit Zymo e filtros de centrifugação
- Também foi seguido o processo de anexação de adaptadores do kit de preparo da Nanopore
Etapa 3: Sequenciamento com Nanopore
- O DNA preparado é injetado na pequena entrada do MinION e conectado via USB
- O software MinKNOW realiza basecalling em tempo real, prevendo A, T, C, G a partir do sinal elétrico com um algoritmo de rede neural
Resultados e limitações
- Foi possível gerar aproximadamente 1 gigabase de dados em duas execuções de sequenciamento, o que representa cerca de 13% de um genoma humano de 3 bilhões de bases
- O primeiro experimento foi interrompido por erro de hardware; houve defeito no flow cell (apenas 623 dos 2.048 poros estavam funcionais)
- 25% da amostra apresentou contaminação de bactérias etc.
- Para análise de SNP (polimorfismo de nucleotídeo único), é necessário sequenciar repetidamente, e a maioria das sequências de bases foi lida apenas uma vez
- Ainda assim, com o custo baixo de US$ 1.100, foi possível obter uma experiência relevante de sequenciamento de parte do genoma humano
Agradecimentos
- Agradeço aos amigos que participaram deste experimento comigo
Ainda não há comentários.