A sequência completa do cromossomo Y humano
(nature.com)- O cromossomo Y, que permaneceu como a última lacuna por causa de longas estruturas palindrômicas e sequências repetitivas, foi concluído como T2T-Y, preenchendo uma grande lacuna do genoma humano de referência
- O GRCh38-Y anterior não incluía mais da metade do cromossomo Y, e a nova sequência tem 62.460.029 pares de bases (bp), acrescentando mais de 30 milhões de bp
- A sequência concluída revela melhor a estrutura amplicônica das famílias gênicas TSPY, DAZ, RBMY e mais 41 genes codificadores de proteínas, em sua maioria da família TSPY
- Na região de heterocromatina Yq12, blocos de human satellite 1 e 3 aparecem de forma alternada, permitindo analisar em todo o cromossomo a distribuição de sequências repetitivas, DNA satélite e motivos de DNA non-B
- O T2T-Y é combinado à montagem do genoma CHM13 e usado como recurso de sequência de referência completa para todos os 24 cromossomos humanos
A última lacuna restante do cromossomo Y
- O cromossomo Y humano era muito difícil de sequenciar e montar por causa de estruturas repetitivas complexas, incluindo longas estruturas palindrômicas, repetições em tandem e duplicações segmentares
- A sequência de referência GRCh38 não incluía mais da metade do cromossomo Y, que permaneceu como o último cromossomo humano ainda não concluído
- O T2T consortium concluiu o T2T-Y, uma sequência completa de 62.460.029 bp do cromossomo Y humano derivado do genoma HG002
- O T2T-Y corrige vários erros do GRCh38-Y e acrescenta mais de 30 milhões de bp à sequência de referência
Novos genes e estruturas repetitivas revelados
- O T2T-Y mostra a estrutura amplicônica completa das famílias gênicas TSPY, DAZ, RBMY
- A nova sequência de referência inclui mais 41 genes codificadores de proteínas, em sua maioria da família TSPY
- Na região de heterocromatina Yq12, foi confirmado um padrão em que blocos de human satellite 1 e 3 aparecem alternadamente
- Com a conclusão da montagem, foi possível avaliar de forma abrangente as sequências repetitivas do cromossomo Y, e também foram identificados arrays satélite até então desconhecidos
- Os novos arrays satélite estavam principalmente em PAR1
- Também foram identificadas repetições de subunidades que fazem parte de uma unidade repetitiva composta em TSPY, RBMY ou DAZ
Dificuldades estruturais reveladas durante a montagem
- A montagem dos cromossomos X/Y de HG002 foi analisada com um assembly string graph baseado em HiFi reads
- A estrutura emaranhada mais complexa ficou restrita à região satélite heterocromática do braço q do Y
- O subgrafo X/Y é conectado em PAR1 e PAR2
- Em PAR1, foi observada uma descontinuidade no grafo causada por viés do sequenciamento HiFi
- Das 11 quebras observadas, 9 estavam em PAR1 dos dois cromossomos
- No cromossomo Y, 5 de 5 estavam em PAR1
- Na região palindrômica P1–P3, a estrutura repetitiva foi resolvida com pruning manual e integração de reads ONT
- Foram destacadas 3 estruturas hairpin em forma de repetição em tandem invertida quase completa, incluindo todo o P3 e os dois palíndromos de P2
- As ambiguidades restantes foram resolvidas por avaliação do alinhamento de reads ONT contra reconstruções candidatas
Validação com Strand-seq e análise de variantes
- A comparação de 65 bibliotecas Strand-seq contra GRCh38-Y e T2T-Y mostrou vários picos de cobertura na direção reversa no GRCh38-Y
- Esses picos sugerem polimorfismo de inversão em relação ao HG002 e podem se dever a diferenças de haplogrupo
- Os mesmos picos não foram observados em T2T-X e T2T-Y, confirmando a estrutura e a precisão de orientação da montagem HG002
- Uma inversão de 3 kb em uma sequência única entre os braços palindrômicos P5 foi identificada como erro do T2T-Y, mas foi confirmada como polimórfica na população e, por isso, não foi corrigida nesta versão da montagem
- No T2T-Y, as mudanças de estado de fita em cada biblioteca Strand-seq ficam distribuídas aleatoriamente, sem evidência de misassembly ou colapso
- Na análise de Extended Data, foi confirmado que 5 de 15 pessoas tinham a variante invertida do palíndromo P3 presente no HG002
PAR, Yq12 e motivos de DNA non-B
- No subgrafo de PAR1, gaps de arestas verdes e cobertura de nós irregular indicam viés de sequenciamento HiFi em toda a PAR1
- PAR1 é rica em repetições SINE e motivos de DNA non-B, e essa característica pode ser a causa das lacunas de sequenciamento
- Na análise da distribuição de motivos de DNA non-B em todo o T2T-Y, HSat3 em Yq e sequências satélite ao redor do centrômero são mais ricas em repetições A-phased, repetições diretas e STRs
- HSat1B é mais rico em repetições invertidas e repetições em espelho
- Também foi observado enriquecimento de sequências de DNA non-B nas regiões PAR
- O array gênico TSPY é rico em motivos G4 e Z-DNA
- Cada cópia de TSPY tem um pico de G4 cerca de 500 bases upstream de TSPY
- Um Quadron score acima de 19 é considerado uma estrutura G4 estável
Recurso de sequência de referência dos 24 cromossomos humanos
- Os pesquisadores combinaram o T2T-Y à montagem existente do genoma CHM13 e mapearam dados disponíveis de variantes populacionais, variantes clínicas e genômica funcional para criar uma sequência de referência completa para todos os 24 cromossomos humanos
- A lista completa de recursos pode ser baixada em marbl/CHM13
- T2T-CHM13v2.0, montagem T2T-CHM13+Y
- reference analysis set
- anotação gênica, anotação de repetições, perfis epigenéticos
- resultados de variant-calling do 1KGP e SGDP
- conjuntos de dados gnomAD, ClinVar, GWAS, dbSNP
- A montagem também é fornecida pelo NCBI e pelo EBI, e o accession no GenBank é GCA_009914755.4
- Anotações e recursos relacionados também podem ser explorados no
hs1do UCSC Genome Browser, no T2T-CHM13v2.0 do Ensembl Genome Browser e no NCBI data-hub - Possíveis problemas da montagem podem ser verificados e acompanhados em marbl/CHM13-issues
Dados de análise e código publicados
- Alinhamentos short-read e variant calls do 1KGP e SGDP estão disponíveis no AnVIL workspace
- Os dados brutos do Gerton lab podem ser acessados no Stowers Original Data Repository
- Os sequencing data usados no estudo estão listados na Supplementary Table 1
- O código customizado desenvolvido para análise e visualização de dados foi publicado no GitHub e no Zenodo
- O software e os parâmetros usados são especificados com detalhes adicionais em Supplementary Methods
1 comentários
Opiniões no Hacker News
Para quem não se lembra da antiga corrida para decifrar o genoma humano, vale acrescentar que os principais concorrentes na época eram a Celera Genomics e o Human Genome Project
A Celera, liderada por Craig Venter, anunciou que havia concluído o sequenciamento, mas na prática usou o método shotgun, coletando pequenas amostras aqui e ali e montando estatisticamente um modelo do genoma; cerca de 5 anos depois, admitiu que não havia decifrado o genoma inteiro
Referência: https://www.technologyreview.com/2007/09/04/223919/craig-ven...
Na época, o sequenciamento shotgun foi criticado como um “atalho”, mas hoje o chromosome walking desapareceu e o shotgun virou o padrão
Se for substituído, será por tecnologias de leituras longas como Oxford Nanopore, mas ainda é preciso montar os dados, e elas ainda não chegam ao ponto de obter diretamente uma sequência contínua de ponta a ponta
35 anos atrás: https://www.nytimes.com/1987/12/13/magazine/the-genome-proje...
33 anos atrás: https://www.nytimes.com/1990/06/05/science/great-15-year-pro...
29 anos atrás, a competição se intensifica: https://www.nytimes.com/1994/02/22/science/scientist-at-work...
24 anos atrás, competição em andamento: https://www.nytimes.com/1999/03/23/science/who-ll-sequence-h...
23 anos atrás, rascunho concluído: https://archive.nytimes.com/www.nytimes.com/library/national...
20 anos atrás: https://www.nytimes.com/2003/04/15/science/once-again-scient...
2 anos atrás: https://archive.nytimes.com/www.nytimes.com/library/national...
A abordagem shotgun da Celera era complicada porque exigia enorme capacidade computacional e algoritmos sofisticados para montar os fragmentos; o cálculo da montagem final exigia, pelo algoritmo e pelos dados, 64 GB de memória compartilhada e foi executado em um AlphaServer GS160 da Compaq
Na época, o GS160 era uma enorme máquina UNIX e podia ser agrupado de forma bem integrada entre várias máquinas, com E/S e sistema de arquivos unificados
O principal autor da montagem shotgun foi Gene Myers, que anteriormente havia criado o BLAST e concebido o suffix array junto com Udi Manber
O projeto público também tinha problemas, pois muitas equipes insistiam em uma abordagem manual e acadêmica; depois que Eric Lander transformou isso em um processo industrial, ele passou a operar o Broad Institute, um instituto privado de pesquisa do MIT/Harvard em Boston
Hoje, petabytes de dados de sequenciamento são gerados diariamente e armazenados na nuvem, e o genoma se tornou uma ferramenta fundamental para a pesquisa humana, mas seu potencial para entender fenótipos complexos ainda não foi plenamente revelado
O que a Celera fez tinha valor e, pelo menos pela minha impressão, eles também não esconderam o que haviam feito
Em vez de “truque estatístico”, é mais correto chamar de inovação
Como a composição genética varia de pessoa para pessoa, fico me perguntando o que exatamente significa dizer que o genoma humano foi completamente decodificado.
As sequências de bases de DNA/RNA não são diferentes para cada pessoa?
https://www.nytimes.com/2002/04/27/us/scientist-reveals-secr...
Pelo que sei, projetos recentes usaram grupos de indivíduos mais amplos.
Alguns projetos misturam vários indivíduos e os decodificam juntos; outros decodificam cada indivíduo separadamente.
A estrutura em larga escala entre humanos é muito parecida, e surgiram métodos sofisticados para modelar variações individuais, então isso não é um grande problema.
Estruturas em grafo que expressam alternativas dentro de uma sequência de referência são descritas em https://www.biomedcentral.com/collections/graphgenomes e podem incluir não só diferenças de uma única base, mas também variações mais complexas, como grandes deleções, rearranjos e inversões.
O genoma de referência funciona como uma Pedra de Roseta da genômica: serve de base para alinhar, entender e comparar sequências de DNA/RNA de outros indivíduos.
Ele não é perfeito, então pode haver regiões ausentes na referência ou regiões de DNA altamente variáveis.
O objetivo do Human Pangenome Reference Consortium (HPRC) https://humanpangenome.org/ é resolver esse problema sequenciando indivíduos de populações diversas, e novos modelos computacionais para analisar os dados de toda a população também estão em desenvolvimento.
Uma abordagem semelhante foi aplicada aos outros cromossomos.
Se um genoma é muitos megabytes de [ATCG]+, fico me perguntando o que ter essa sequência nos diz.
É só olhar e dizer “ah, ...ATGCTACGACTACGACTAGCG... interessante”?
Houve artigos que chamaram atenção, incluindo um artigo de Guarracino e Garrison na Nature no começo deste ano.
Um pangenoma geralmente é um modelo complexo em grafo que conecta centenas ou mais genomas/haplótipos de uma espécie, e conceitualmente pode ser estendido para além de espécies ou para células dentro de um indivíduo, como um pangenoma de câncer.
Em um grafo idealizado do pangenoma humano, cada pessoa é representada por dois caminhos sobre cada autossomo e por caminhos que passam pelos cromossomos X e Y e pelo genoma mitocondrial.
Entendo que a razão pela qual decodificar genes é difícil é que a maioria dos métodos primeiro divide aleatoriamente longas sequências genéticas em fragmentos e depois decodifica cada fragmento separadamente.
Para obter o genoma completo, é preciso recolocar esses fragmentos na ordem correta; isso é possível porque há sobreposição entre fragmentos, mas, quando há regiões repetidas, é difícil juntá-los corretamente usando só as sobreposições.
Também existe uma técnica nova chamada Nanopore, em que o DNA passa de fato por um pequeno poro e as propriedades elétricas mudam conforme os pares de bases dentro do poro.
No entanto, ela tende a gerar erros de maneira determinística dependendo da sequência e, como não consigo ver o artigo completo, não sei exatamente o que foi feito aqui, mas já ouvi dizer que combinam as duas abordagens.
Depois usaram sequenciamento Nanopore para conectar os contigs HiFi e cobrir regiões realmente difíceis do cromossomo.
Pelo que entendi, todo sequenciamento moderno em larga escala é shotgun sequencing.
O DNA é quebrado aleatoriamente, cada fragmento é decodificado e então as leituras, isto é, os fragmentos individuais, são montadas por um montador de genoma.
Há uma “pergunta idiota” que sempre tive sobre registros do genoma humano.
Como todos nós temos DNA diferente, fico me perguntando se o “genoma humano” é algo como um DNA médio, o DNA de alguém usado como amostra, ou um esboço do que todos nós temos em comum.
As diferenças entre pessoas são relativamente pequenas, da ordem de alguns milhões de bases entre 3 bilhões.
Historicamente, o genoma de referência era mais próximo de uma média/mosaico de vários indivíduos e, embora as desvantagens sejam claras, ele era suficiente para colocar as leituras em posições geralmente corretas e identificar variantes, as diferenças que tornam único o genoma analisado.
A referência T2T end-to-end mais recente é inteiramente baseada no indivíduo HG002, de Utah, graças a novas informações vindas de tecnologias de leitura longa.
Se você precisa de um modelo populacional do genoma, precisa de um pangenoma.
Pesquise por “pangenome graph”, “variation graph” e human pangenome project.
Esta notícia deveria ser de dezembro do ano passado, não de agora.
A equipe T2T publicou um preprint [1] em dezembro do ano passado e disponibilizou os dados [2] em março, mas só agora saiu oficialmente na Nature por causa do processo de revisão por pares.
O cronograma de publicação pode ser realmente lento, e cientistas interessados já sabiam disso e estavam trabalhando com essa montagem; nesses casos, fico me perguntando qual é o sentido da publicação formal.
[1] https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.12.01.518724v1....
[2] https://github.com/marbl/CHM13
Isto está mais próximo de “temos um driver de teclado funcionando”, ou de “identificamos todas as 104 teclas do layout padrão US QWERTY de 104 teclas”?
Entendemos alguns comandos CNC, mas ainda não temos uma boa compreensão dos mecanismos de controle nem da ordem
Um dia vamos identificar as teclas, mas ainda estamos muito longe de um driver e, mais importante, ainda estamos longe de saber o que cada tecla faz
Só descobrimos que, se alterarmos certos bits dos dados brutos, o teclado quebra de maneiras interessantes
Isto é um acontecimento bem grande
Significa que agora todos os 24 cromossomos foram completamente decodificados e, como diz o resumo, o cromossomo Y era difícil de decodificar até agora por causa de suas características
Depois terminou em 2022, e agora dizem que terminou de novo
Fico curioso para saber se ainda há marcos restantes rumo a uma “nova conclusão” no futuro
O cromossomo Y era realmente considerado uma exceção até agora?
Como um aparte, recomendo muito Y - The Descent of Man, de Steve Jones, um livro muito divertido e educativo
É empolgante ver mais cromossomos sendo mapeados e decodificados
Perguntando com conhecimentos de biologia do ensino médio: em genes, expressão gênica e interações, será que já fomos além da correlação e chegamos a uma compreensão determinística?
Usando “olhos azuis” como exemplo: [1] sabemos que OCA2 está envolvido na cor castanha/azul dos olhos, mas podemos ter certeza de que os outros 20.000 genes não estão envolvidos de forma alguma, ou não são necessários?
Especulando como leigo, parece que, para obter olhos azuis, vários genes precisam estar todos ligados, ativados ou presentes; parece mais uma receita do que um simples liga/desliga em uma única posição
[0] https://www.goodreads.com/work/editions/436071-y-the-descent...
[1] https://www.nature.com/articles/s41433-021-01749-x
O problema começa por como definir olhos azuis
Não é um único fenótipo: há várias faixas de olhos azuis, e essas diferenças correspondem a variações bastante sutis entre pessoas
O artigo linkado [1] é muito bom, mas exige um bom tempo para ser entendido por completo
Afinal, para ter olhos azuis é preciso ter olhos, e para verificar a cor também são necessários vários mecanismos para abrir os olhos
Por exemplo, só relativamente recentemente a epigenética avançou muito; em termos amplos, ela estuda como o comportamento celular muda mesmo sem que o DNA em si mude [1]
Isso nos leva a reformular de modo mais refinado a antiga pergunta sobre influências ambientais e genéticas
Não tenho certeza absoluta de quantos cromossomos estão envolvidos na determinação da cor dos olhos, mas há estimativas bem boas
Uma estimativa recente é de cerca de 16, com OCA2 e HERC2 tendo os maiores efeitos, embora muitos outros genes também tenham efeitos menores [2]
O artigo citado é excelente, mas também aborda temas mais próximos de uma disciplina introdutória de faculdade/AP Biology do que da biologia padrão do ensino médio, como regulação gênica, íntrons e éxons
De modo mais geral, acho difícil chegarmos em breve a um ponto em que possamos afirmar algo em genética de forma 100% completa e determinística
A genética e a biologia em geral avançaram enormemente, mas não devemos subestimar a complexidade do genoma humano como se isso fosse óbvio
Claramente ainda há coisas que não entendemos, e isso continuará por algum tempo
Na prática, mesmo fenótipos simples como a cor dos olhos podem ser influenciados por outros genes, mas normalmente é possível estimar com bastante precisão usando apenas alguns genes
Por exemplo, um estudo previu a cor dos olhos com cerca de 75% de precisão usando apenas 6 genes [3]
O mais interessante é que, às vezes, genes que influenciam um fenótipo não armazenam diretamente a informação genética que determina aquela característica
Ou seja, esse gene não determina diretamente a característica; ele influencia outro gene, e esse outro gene está envolvido de forma mais direta na expressão da característica
Vários genes influenciam uns aos outros, e ainda outros genes, além de ser preciso considerar vieses ambientais e demográficos nas pesquisas; dá para ver como a genética se torna complexa muito rapidamente
[1] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2791696/
[2] https://www.nature.com/articles/jhg2010126
[3] https://doi.org/10.1016/j.cub.2009.01.027
Esta é uma notícia empolgante
Se quiser saber sobre aplicações deste trabalho, vale ver esta palestra keynote da ACM SIGPLAN: https://youtu.be/JTU3JYp3JYc?si=jOZz611ATQar3Gec
Ajudou-me a entender DNA melhor do que todas as aulas de biologia do ensino médio